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第九讲 干细胞再造大脑?

发布时间:2018-06-13  浏览次数:625次

人类的大脑在结构和功能上都是高度复杂的,大脑是人类学习活动和自身进化的重要结构基础。长期以来,传统观念认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力,一旦受损或死亡,将不能再生。这种观点使得帕金森病等神经退行性疾病和脑、脊髓损伤的治疗受到很大限制,当前治疗原则只是减少症状和防止病变进一步发展,效果不满意,且严重影响病人的生活质量。近十年来,神经生物学领域取得重大突破,即发现了神经干细胞(neural stem cells, NSCs),特别是成年脑内神经干细胞的分离、鉴定和中枢神经系统(CNS)再生机制的研究具有划时代意义。那种脑组织不能被再生的观念已经成为历史了,神经干细胞为修复神经退行性疾病和中枢神经系统的损伤带来了希望。

第一节 神经干细胞与神经元发生
           神经干细胞是大脑发育、神经再生的源泉以及脑进化的细胞基础,它的突出特点是能够自我更新和向多种细胞分化,其英文名“stem”是“茎”的意思,即指发育的源泉。神经干细胞分为胚胎神经干细胞和成年神经干细胞两类。人类已对胚胎神经干细胞做了大量的研究工作,最近科学家也研究发现,由成年神经干细胞生成的神经元在体外培养以及体内都能对脑损伤进行神经再生修复。另外,还可通过基因的手段修饰干细胞,表达一些神经营养因子,用于神经系统疾病的基因治疗,为许多难治的颅脑疾病提供了新的治疗方法。

           神经干细胞能产生脑内三种主要细胞类型,即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,并具有很强的迁徙性。神经干细胞在内在因素和种外在环境信号调控下通过分化限制机制发育为神经限制性前体细胞和胶质限制性前体细胞,具体的分化过程见1


一.神经干细胞的特点及分布
(一).神经干细胞与神经发育
           神经干细胞的特点有:第一是不断分化成子代细胞;第二,通过分裂产生相同的神经干细胞来维持自身的数量,同时也能产生子细胞并进一步分化成各种成熟细胞,即自我更新。干细胞可连续分裂几代,也可在较长时间内处于静止状态。第三,它的生长方式有两类,一是对称分裂,形成两个相同的神经干细胞;另一种是非对称分裂,这由细胞质中的调节分化蛋白(numb蛋白 )不均匀分配引起,最后一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞,另一个子细胞则保持亲代的特征,仍作为干细胞保留下来(2)。另外,迁移性也是神经干细胞的突出特征。在胚胎发育中,神经干细胞不断迁移至特定区域,构建出复杂的中枢神经系统。其迁移方式有辐射式和切线式两种,辐射式是多个神经干细胞从一个中心区域向各个方向迁移;切线式则指神经干细胞沿一条切线前后鱼贯而行。

           神经干细胞在神经系统发育、维持和再生中发挥着关键作用。胚胎期,位于神经管上皮层的神经干细胞在精确的时间和空间信号的调控下进行不对称分裂产生限制性祖细胞。这些祖细胞在胶质细胞放射状突起的引导下发生向心性迁移(3),同时在局部环境信号的诱导下分化并作切线位迁移,最终形成相应的神经细胞,从而完成脑皮层构建,随后神经干细胞向胶质细胞分化,完成脑白质的构建。

【资料1】
1.numb蛋白与神经干细胞分化(图2)

2.神经干细胞的辐射状迁徙(图3)

【资料2】
    按分化潜能的大小,干细胞可分为3种类型:第一类是全能干细胞,它有形成完整个体的分化潜能,具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力,可以无限增殖分化成全身组织细胞,并进一步形成机体的所有组织、器官进而形成个体;第二类是多能干细胞,这种干细胞也具有分化多种细胞组织的潜能,但失去发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定限制;第三类是单能干细胞,如神经干细胞等,这种细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化。但是研究也发现一个很有趣的现象,即在特定的条件下它们也能跨系横向分化,如神经干细胞可以分化成造血细胞或反之等。

【思考题】:干细胞跨系横向分化的特征有什么意义吗?

(二).神经干细胞的分布
   研究发现,神经干细胞在脊椎动物胚胎期神经系统中广泛分布。在神经管形成以前,在整个神经板都可检测到神经干细胞的选择性标记物,即神经巢蛋白(nestin);在神经管形成后,神经干细胞位于神经管的脑室壁周边。目前已在鼠胚胎大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、脑室附近、间脑、中脑、小脑、脊髓中分离出神经干细胞。

           而成年动物大脑的前脑脑室下区(SVZ)和海马齿状回是成年神经干细胞的主要分布区。在啮齿类动物中,脑室下区的干细胞不断沿着嘴侧延长区向嗅球迁徙,构成嘴侧迁移流,并最终分化为嗅球的中间神经元。但是人类大脑和啮齿类动物的大脑明显不同,研究发现,在人类大脑中除了前脑脑室下区和海马齿状回外,还存在前额叶深部腹侧区等干细胞聚集区;另外在小脑、脑干、脊髓等区域也分离到神经干细胞。

【资料3】
           中枢神经系统来源于原肠胚时期的背侧表面的一层上皮样细胞,即由外胚层形成的神经板;在发育的过程中,神经板两侧逐渐向中线卷起合拢形成一管,即神经管(4)。神经管的前部最初分化为三个稍膨大、分界明显的脑泡:即前脑泡,中脑泡和后脑泡。此后发育为端脑,间脑,中脑,后脑和延髓。神经管后部较为狭窄的部分形成脊髓。

(三).神经干细胞的分化原理
           神经干细胞发育的调控机制非常复杂,概括起来讲主要分为内源性和外源性两大类。内源性调控指神经干细胞自身的转录因子及其它功能蛋白对其发育的调控,目前研究最多的是bHLH基因等;外源性调控则是神经干细胞所处的微环境对其发育过程的调控,调控的因素种类繁多,包括细胞因子[如表皮生长因子(EGF)和碱性纤维细胞生长因子(bFGF)等]、细胞间直接接触作用以及细胞外基质等,这些分子通过一定信号途径(notch信号等)影响神经干细胞的增殖分化等行为。

           虽然神经干细胞能不断增殖、分化形成脑内的各种神经细胞,但如何使其转化为所需要的神经细胞种类却是很棘手的难题,而这对临床治疗又有重大意义。例如,如何控制神经干细胞向多巴胺神经元方向分化将用于帕金森氏病的治疗。

           体外研究发现,从大鼠多巴胺能神经元发育的部位分离出来的神经干细胞,在体外并不能分化为多巴胺神经元,但当在培养基中加入白介素-1时可诱导神经干细胞向多巴胺神经元分化。分化出的神经元具有多巴胺神经元的生化特点,如表达酪氨酸羟化酶、多巴胺等;但缺乏多巴胺神经元的形态特征,胞体呈圆形而无突起。而联合应用白介素-1,胶质细胞源性神经营养因子和白细胞抑制因子等后,分化的多巴胺神经元不仅数量增加,而且随着时间延长逐渐出现较多突起,其形态类似于脑内的多巴胺神经元。

二、神经元的形成及调亡

(一).神经元的形成
           随着神经管的形成,神经管由原来的柱状上皮变为假复层上皮,称神经上皮,其以基底面附着于神经管的管腔。研究发现,在神经上皮分裂周期中,它在神经管内、外壁间不断的作往返迁移(5)。有丝分裂后的细胞开始向神经管外壁迁移,它们是沿着神经胶质细胞伸出的、辐射状排列的突起进行的(图3)。由于细胞的聚集形成外套层并逐渐增厚,此时增殖的神经上皮称为室管膜,在外套层和神经管外壁之间的为边缘层。外套层的细胞分化、向外迁移又形成一个中间层。

那么神经管各个区域的神经祖细胞是如何分化发育成神经细胞的。与神经干细胞相比,神经祖细胞是有限定潜能的、具有明确分化方向的一种细胞,也能自我更新并且分化为神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞;而神经前体细胞泛指那些处于发育更早期的细胞。神经元发生的分子机制涉及notch信号和numb蛋白。研究发现,神经发生的过程既是决定性的又是非决定性的,这取决于notch信号是自发作用还是受numb蛋白调控。原神经区内notch信号控制细胞分化为神经元的概率是随机的;但是祖细胞有丝分裂后子细胞获得的特定蛋白决定其归宿,即神经元的发生始于numb等成分在祖细胞不对称分裂时的分布及成神经细胞迁移到皮质板(图2)。

(二).神经元靶位影响神经元的存活
           【资料4】
           上世纪20年代,科学家Samuel Detwiler和Viktor Hamburger发现在果蝇胚胎背侧基底神经节靶位再移入一个附肢芽时,感觉神经元的数目增多;而移去正常附肢时感觉神经元的数目则减少,当时他们认为是靶位影响感觉神经母细胞的增生和分化。而到40年代,Rita  Levi-Montalcini历史性的发现在胚胎发育过程中神经元的死亡是正常现象,她和Viktor Hamburger发现移去鸡胚附肢后支配的感觉神经元会过量死亡。在中枢神经系统发育过程中神经元也会发生死亡,Hamburger发现在鸡胚发育过程中,约半数脊髓中间外侧运动神经元死亡;而且,移去靶位后发生死亡的神经元数目增多,移入一额外靶位时发生死亡的神经元数目减少(6)。因此,神经元靶位对神经元的存活至关重要。

此后,Hamburger和Levi-Montalcini首次提出神经营养因子假说,认为神经元发育过程中靶位分泌一些营养因子,那些不能获得足够神经营养因子的神经细胞发生凋亡。基于此假说,Levi-Montalcini和Stanley Cohen在培养感觉神经元时提取出第一个神经营养因子,即神经生长因子(NGF)。NGF是个里程碑式的发现,它们与酪氨酸激酶受体结合介导其信号转导。神经元靶位分泌的数量有限的神经营养因子对神经元的存活至关重要,去除神经营养因子及其受体将导致神经元死亡。许多实验均已证实此观点,例如NGF或trkA基因突变的小鼠体内缺少交感神经节。

(三).神经元的凋亡机制
           剥夺神经营养因子可激活神经元的死亡程序。神经营养因子起先被认为是通过促进神经元代谢(“营养”作用)而有助于神经元存活的,实际上这是它抑制神经元程序性死亡,即凋亡(apoptosis)的结果。体内所有细胞都有发生凋亡的潜能,这是机体维持内环境稳定的重要机制之一。凋亡包括一系列生化反应:如细胞萎缩、染色质浓缩,细胞碎裂及巨噬细胞吞噬作用等,这些与外伤引起的细胞坏死不同,后者的显著特征是有炎症反应。凋亡过程是受基因调控的、通过激活或动员细胞内一连串级联反应的细胞死亡程序,其调节基因很多,包括ced,bcl-2家族基因、caspases家族基因等。

第二节 成年脑内神经再生
           【思考题】:在上一节中,我们提到神经干细胞参与发育中神经系统的形成。那么神经干细胞是否能重建一个大脑呢?

据认为,哺乳动物神经元细胞的产生大都限制出生前阶段,而成年大脑则缺失干细胞,因此在受伤后不能形成新的神经细胞和再生。一直到20世纪60年代,有研究首次报道成年啮齿类动物不同脑区存在神经发生。随着标记分裂细胞的新技术的来临,如BrdU标记(BrdU是胸腺嘧啶同源物,用作记录和检测细胞增殖),逆病毒标记以及共焦显微镜等,研究人员证实啮齿类动物不同脑区在整个成年都有神经发生,并重新评估和阐述了猿长类动物、人类和非人类中神经发生的证据。据推测新生的神经元来自成年大脑的干细胞。最近,成年大脑中神经祖细胞和干细胞的分离和特征化进一步支持了上述假设。成年大脑中有神经发生和成年中枢神经系统中存在NSCs的证实,对我们理解大脑发育和功能以及中枢神经系统的细胞治疗具有深远意义。

一.成年神经干细胞的起源与功能

(一).成年神经干细胞的起源
           在成年灵长类动物包括人类大脑的哪些区域中存在着神经再生现象? 是否可从中分离出成年神经干细胞?这是干细胞研究者和神经科学家极为关注的问题。1992年,Reynolds和Weiss首次从成年鼠纹状体(包括前脑脑室下区)分离和鉴定出一群未分化的细胞或神经祖细胞,神经祖细胞/干细胞标记物nestin呈阳性。1995年,Gage从成年鼠海马也分离到类似的细胞。

           成年大脑的前脑脑室下区(SVZ)和海马齿状回是两个干细胞聚集区(3)。在正常情况下中枢神经系统的神经再生伴随于成年动物的一生,但随着年龄增长其再生水平有下降趋势。在啮齿类动物的研究中发现,SVZ区域的干细胞不断地沿着嘴侧延长区向嗅球迁徙,构成嘴侧迁移流,并最终分化为嗅球的中间神经元。但是人类大脑和啮齿类动物的大脑明显不同,人类大脑前额叶高度发达,而啮齿类动物嗅脑相对很大。因此有学者推测可能在人类大脑中还存在着其它干细胞聚集区,如前额叶深部腹侧区等。

【思考题】:成年大脑内不同部位的干细胞之间有什么样的关系呢?
           有学者做了下面的实验:将人胚神经干细胞注射到胚胎猴脑室中,观察了胚胎发育过程中神经干细胞的迁徙和分化过程。发现4周后这些外源性神经干细胞分成两群细胞,一群细胞参与形成大脑皮层,而另一群则在脑室下区保持静止的未分化状态。处于静止未分化状态的干细胞可能分为数个干细胞储备池,参与出生后大脑内的神经再生。因此,从成年大脑不同部位中分离出的神经干细胞很可能是起源早期干细胞群的储备池。

(二)、成年神经干细胞的功能
           以往的观点认为成年动物大脑中的神经元数量是稳定不变的,目前对成年神经干细胞的研究改变了这一认识。成年海马的神经再生与海马功能有着密切关系:学习或奔跑可以改变动物海马细胞存活或细胞增殖水平,从而增加海马的新生神经元的数目;而紧张、滥用鸦片和癫痫发作等可以影响到成年海马齿状回新生神经元的增殖和分化水平。

           由神经干细胞产生的新生神经元参与其所在海马区域的正常功能。用实验方法人为减少动物海马颗粒样神经元的数目后,其海马依赖性记忆功能受到损害。超微结构检查显示这些细胞具有成熟突触形态。海马脑片电生理分析表明,绿色荧光蛋白(GFP)标记的成年神经干细胞产生的新生颗粒细胞具有与成熟神经元相似的电生理特征,包括可重复的动作电位和自发性突触后电流,并且也可以接收突触传入信号。将新生神经元与成熟海马神经元共同培养,结果发现新生神经元在离体实验研究中同样具有电生理特性,在新生神经细胞上可以记录到兴奋性和抑制性突触电流,而且这些突触电流可以被谷氨酸或γ-氨基丁酸(GABA)受体抑制剂阻断,甚至刺激成熟海马神经元可以立即引起新生神经元的突触动作电位。这些证明了由成年海马神经干细胞产生的新生神经元不仅在形态上与成熟海马神经元相同,而且对突触刺激有动作电位反应,并且可以有效地整合到神经环路中去,表现出一定的功能。

(三).成年神经干细胞的基因表达
2004年,Gage  小组研究发现成年神经干细胞表达TLX基因。TLX最初在小鼠的胚胎第8天开始表达,在13.5天达高峰而在第16天开始下降,出生时几乎不能检测到。TLX在出生后表达增加,在成年大脑中表达量最高。TLX基因缺陷小鼠成年后表现出视网膜病变和大脑半球萎缩。从组织学上看,所有突变小鼠的成年大脑神经再生活跃区域如海马齿状回很小、脑室扩大并且嗅球体积变小。经过克隆分析,表达TLX的神经干细胞克隆都具有自我更新的能力。而且这些初级和次级克隆经过诱导都可以分化为神经元、胶质细胞和少突胶质细胞,这表明表达TLX的细胞是多能的。TLX可能是一系列参与建立神经干细胞分化和增殖状态的目标基因的关键性调控子。

二.成年脑内神经发生

(一).胶质细胞与神经干细胞
           胶质细胞是人脑中数量最多的细胞。在脑发育过程中,放射状胶质细胞在脑室区与皮层内形成脚手架样结构,引导脑室区神经元向皮层迁徙(见前一节)。然而,在成年人脑的深部存在着一群特殊的细胞,它们不仅表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP),而且具有糖原颗粒、粗束中间纤维等星形细胞样形态结构。脑室区放射状胶质细胞可以持续产生神经元,因此放射状胶质细胞可能是成年神经干细胞的一种特殊类型。在脑室下区,Sanai等研究人员用免疫荧光标记脑组织标本(来自外科手术以及尸解)中细胞周期标记物Ki67,并报道成年大脑含有星形胶质细胞彩带(衬于侧脑室),这在其他脊椎动物中并未发现,包括非人灵长类。GFAP共表达和细胞分裂标记物Ki67证实了星形胶质细胞彩带中有些细胞分裂。但是,Sanai等没有找到脑室下区神经母细胞的迁移流或向嗅球迁移通路证据。

           另一方面,星形胶质细胞、室管膜细胞和血管内皮细胞形成胶质血管网络,不仅参与脑结构和功能的构建,而且为神经祖细胞提供了“发生龛”(niches)。星形胶质细胞和血管内皮细胞通过旁分泌各种细胞因子决定发生龛内神经干细胞的分化方向。

(二).妊娠对成年神经再生的影响
           嗅觉和嗅觉识别能力在动物交配、识别和哺育后代中起着重要作用,因此形成一种新的嗅觉记忆在哺乳动物的母性行为中是必需的。研究发现怀孕可以增强脑室下区的细胞增殖,从而刺激了嗅球新生中间神经元的产生。催乳素存在于所有的脊椎动物和无脊椎动物神经组织中,而且催乳素受体在邻近脑室下区的区域和前脑脑室脉络丛都有着较高的表达。催乳素脑内注射可以模拟怀孕所诱导的神经再生。催乳素和怀孕诱导的神经再生之间存在着明确的功能联系。培养的神经干细胞可以表达催乳素受体,催乳素协同上皮生长因子(EGF)促进神经干细胞的增殖和自我更新。有趣的是,在人类中不管是男性还是女性性欲高潮后血浆催乳素水平都显著增加。这些现象提示,生理性欲高潮也有可能激活神经干细胞提高其增殖和分化为神经元的能力。因此,催乳素有可能成为一种潜在的治疗药物,来增强病损后大脑的内在的神经再生。

【资料1】
           名词解释:
1.神经巢蛋白(nestin)
2.胶质纤维酸性蛋白(GFAP)
3.发生龛(niches)
4.绿色荧光蛋白(GFP)

三.神经干细胞治疗神经系统疾病
           曾经采用胚胎神经组织细胞悬液作为神经替代手段用于治疗帕金森病(Parkinson’s  disease),移植后能部分改善年龄在60岁以下患者的临床症状,但60岁以上患者症状未见显著改善。然而,胚胎神经组织移植不可避免的面临着伦理学、供体组织缺乏、移植组织存活率低等问题,从而限制了其临床应用。另外,在鼠类和灵长类动物模型中,用胚胎干细胞(ESC)起源的神经细胞移植治疗帕金森病等中枢神经系统疾病也取得一定疗效,但同样也面临着免疫排斥反应问题。而神经干细胞在一定程度上克服了这些缺点,成为治疗研究的主要细胞来源。有研究人员将畸胎瘤细胞NT-2细胞系来源神经干细胞用于治疗12例因卒中引起运动功能障碍的患者,发现干细胞移植能增加移植区代谢,改善其运动功能,但NT-2细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其进一步的临床应用。成人神经干细胞的临床应用是各国科学家关心的问题。采用自体移植可以避免由免疫系统引起的排斥反应,而且移植的细胞来源于同一个体,移植后细胞相容性好,干细胞可以长期存活,更易进行迁徙和产生细胞间的联系。但是成人神经干细胞应用于临床时仍应谨慎以保证安全性。

【资料2】:帕金森病的神经退行通路

           而脊髓损伤等神经创伤性疾病的治疗则面临着更大的障碍。脊髓严重损伤的患者要完全康复几乎是不可能的,患者目前只能获得功能的有限恢复,如原来不能动,现在可以部分的使用四肢,或者是恢复了膀胱的功能,或者是免于痛苦。在脊髓损伤中有多种类型细胞受损,包括传递信息的神经元,要让这些神经元长过受伤位点,并且与他们的靶神经适当连接是极困难的事情。在很多脊髓损伤中,脊髓实际上并没有被切断,至少有些信号传输的神经轴突是完整的。但是,因为少突胶质细胞的绝缘髓鞘破坏了,这些存活的轴突就不再能携带信息了。研究人员最近已在取代这些失活的产髓磷脂细胞方面走出了第一步。例如,研究人员已表明干细胞可以在啮齿类动物协助髓鞘再生。很特别的是,他们发现了来自鼠的胚胎干细胞的少突胶质细胞注射可以使化学性脱髓鞘的鼠脊髓髓鞘再生,与对照组相比,治疗组鼠可以有限的使用他们的后肢。

           在尝试使用干细胞来治疗神经系统损伤之前必须要做大量的基础和临床研究。目前成人神经干细胞的临床研究还处于起步阶段,其临床应用还有许多问题拯待解决,如移植神经干细胞,还是移植干细胞诱导分化后的神经元,何者更为有效;神经干细胞迁移以及与组织结构融合的细胞内、外环境调节控制机制尚需研究清楚;干细胞移植的最佳时间窗有待于明确。但是,无论是通过发展替换细胞技术还是激活机体体内自身的干细胞,对神经系统疾病使用干细胞的研究都很有价值。此研究可以回答关于如何修复神经系统损伤的关键性问题以及如何恢复由疾病或残疾引起的主要功能损害。神经干细胞的研究和应用已经为人脑再生医学开辟了新的路径,这些研究的进展将大力推动人类对自身大脑神经生物学认识的深入和临床神经科学的发展。